Jednou z hlavních výhod buněčné kultury je schopnost manipulovat s fyzikální chemií reprodukce buněk (tj. teplotou, pH, osmotický tlak, napětí O2 a CO2) a fyziologickým prostředím (tj. koncentrace hormonů a živin).Kromě teploty je kultivační prostředí řízeno růstovým médiem.
Ačkoli fyziologické prostředí kultury není tak jasné jako její fyzikální a chemické prostředí, lepší pochopení složek séra, identifikace růstových faktorů potřebných pro proliferaci a lepší pochopení mikroprostředí buněk v kultuře.(tj. interakce buňka-buňka, difúze plynu, interakce s matricí) nyní umožňuje kultivaci určitých buněčných linií v médiu bez séra.
1.Prostředí kultury ovlivňuje buněčný růst
Vezměte prosím na vědomí, že podmínky buněčné kultivace se pro každý typ buněk liší.
Důsledky odchylky od kultivačních podmínek požadovaných pro konkrétní buněčný typ se pohybují od exprese abnormálních fenotypů až po úplné selhání buněčné kultury.Proto doporučujeme, abyste se seznámili s buněčnou linií, o kterou máte zájem, a přísně dodržovali pokyny uvedené u každého produktu, který ve svém experimentu používáte.
2. Opatření pro vytvoření optimalizovaného prostředí buněčné kultury pro vaše buňky:
Kultivační média a sérum (více informací viz níže)
Úrovně pH a CO2 (více informací viz níže)
Kultivujte plast (více informací viz níže)
Teplota (více informací viz níže)
2.1 Kulturní média a sérum
Kultivační médium je nejdůležitější součástí kultivačního prostředí, protože poskytuje živiny, růstové faktory a hormony potřebné pro růst buněk a reguluje pH a osmotický tlak kultury.
Ačkoli počáteční experimenty s buněčnými kulturami byly prováděny s použitím přírodních médií získaných z tkáňových extraktů a tělních tekutin, potřeba standardizace, kvalita médií a zvýšená poptávka vedly k vývoji definitivních médií.Tři základní typy médií jsou bazální média, média se sníženým sérem a média bez séra a mají různé požadavky na suplementaci séra.
2.1.1 Základní médium
Buněčné kultivační médium Gibco
Většina buněčných linií dobře roste v základním médiu obsahujícím aminokyseliny, vitaminy, anorganické soli a zdroje uhlíku (jako je glukóza), ale tyto formulace základních médií musí být doplněny sérem.
2.1.2 Médium s redukovaným sérem
Láhev s Gibco Low Serum Medium
Další strategií ke snížení nepříznivých účinků séra v experimentech s buněčnými kulturami je použití média se sníženým obsahem séra.Médium se sníženým sérem je základní receptura média bohatá na živiny a faktory živočišného původu, které mohou snížit množství potřebného séra.
2.1.3 Médium bez séra
Láhev s médiem Gibco bez séra
Médium bez séra (SFM) obchází použití zvířecího séra tím, že sérum nahrazuje vhodnými nutričními a hormonálními přípravky.Mnoho primárních kultur a buněčných linií má formulace média bez séra, včetně produkční linie rekombinantního proteinu z vaječníků čínského křečka (CHO), různých hybridomových buněčných linií, hmyzích linií Sf9 a Sf21 (Spodoptera frugiperda), jakož i hostitele pro produkci viru. (například 293, VERO, MDCK, MDBK) atd. Jednou z hlavních výhod použití bezsérového média je možnost učinit médium selektivním pro specifické typy buněk výběrem vhodné kombinace růstových faktorů.V následující tabulce jsou uvedeny výhody a nevýhody bezsérových médií.
Výhoda
Zvyšte jasnost
Konzistentnější výkon
Snadnější čištění a následné zpracování
Přesně posoudit funkci buněk
Zvyšte produktivitu
Lepší kontrola fyziologických reakcí
Vylepšená detekce buněčného média
Nevýhoda
Požadavky na složení média specifického pro typ buňky
Vyžaduje vyšší čistotu činidla
Zpomalení růstu
2.2.1 Úroveň pH
Většina normálních savčích buněčných linií roste dobře při pH 7,4 a rozdíly mezi různými buněčnými liniemi jsou malé.Ukázalo se však, že některé transformované buněčné linie rostou lépe v mírně kyselém prostředí (pH 7,0 – 7,4), zatímco některé normální fibroblastové buněčné linie preferují mírně alkalické prostředí (pH 7,4 – 7,7).Hmyzí buněčné linie jako Sf9 a Sf21 rostou nejlépe při pH 6,2.
2.2.2 Úroveň CO2
Růstové médium kontroluje pH kultury a pufruje buňky v kultuře, aby odolávaly změnám pH.Obvykle je tohoto pufrování dosaženo tím, že obsahuje organické (například HEPES) nebo pufry na bázi CO2-bikarbonátu.Protože pH média závisí na jemné rovnováze rozpuštěného oxidu uhličitého (CO2) a hydrogenuhličitanu (HCO3-), změny atmosférického CO2 změní pH média.Proto při použití média pufrovaného pufrem na bázi CO2-bikarbonátu je nutné použít exogenní CO2, zejména při kultivaci buněk v otevřených kultivačních miskách nebo při kultivaci transformovaných buněčných linií ve vysokých koncentracích.Ačkoli většina výzkumníků obvykle používá 5-7% CO2 ve vzduchu, většina experimentů s buněčnými kulturami obvykle používá 4-10% CO2.Každé médium má však doporučené napětí CO2 a koncentraci hydrogenuhličitanu pro dosažení správného pH a osmotického tlaku;více informací naleznete v pokynech výrobce média.
2.3 Pěstování plastů
Plasty pro buněčné kultury jsou dostupné v různých formách, velikostech a površích, aby vyhovovaly různým aplikacím buněčných kultur.Použijte plastové povrchové vodítko pro buněčnou kulturu a průvodce nádobou na buněčnou kulturu níže, které vám pomohou vybrat správný plast pro vaši aplikaci buněčných kultur.
Zobrazit všechny plasty pro buněčné kultury Thermo Scientific Nunc (reklamní odkaz)
2.4 Teplota
Optimální teplota pro buněčnou kulturu závisí do značné míry na tělesné teplotě hostitele, ze kterého jsou buňky izolovány, a v menší míře na anatomických změnách teploty (např. teplota kůže může být nižší než teplota kosterního svalu). ).Pro buněčnou kulturu je přehřátí vážnější problém než přehřátí.Proto je teplota v inkubátoru obvykle nastavena mírně pod optimální teplotu.
2.4.1 Optimální teplota pro různé buněčné linie
Většina lidských a savčích buněčných linií se udržuje při 36 °C až 37 °C pro optimální růst.
Hmyzí buňky se kultivují při 27 °C pro optimální růst;rostou pomaleji při nižších teplotách a teplotách mezi 27°C a 30°C.Nad 30°C se vitalita hmyzích buněk snižuje, i když se vrátí na 27°C, buňky se neobnoví.
Ptačí buněčné linie potřebují 38,5 °C k dosažení maximálního růstu.Ačkoli lze tyto buňky uchovávat při 37 °C, rostou pomaleji.
Buněčné linie odvozené od studenokrevných živočichů (jako jsou obojživelníci, studenovodní ryby) mohou tolerovat široký teplotní rozsah od 15 °C do 26 °C.
Čas odeslání: 01.02.2023